核仁小 RNA(snoRNAs)是一類廣泛存在于真核生物細胞核仁的小分子非編碼 RNA,長度60-300nt,能與核仁核糖核蛋白結(jié)合形成 snoRNPs 復(fù)合物[1]。在脊椎動物中編碼核仁小 RNA 的基因主要存在于蛋白編碼基因或非蛋白編碼基因的內(nèi)含子區(qū)域,并且經(jīng)過進一步的轉(zhuǎn)錄后加工處理形成成熟的核仁小 RNA[2]。具有保守的結(jié)構(gòu)元件,按結(jié)構(gòu)可以分為三類:box C/D snoRNA、 box H/ACA snoRNA 和 MRP RNA(研究較少)。在核糖體 RNA 的加工過程中,前兩類 snoRNAs 分別發(fā)揮兩種修飾作用:核糖體 RNA 的 2 -O– 甲基化和假尿嘧啶化[3]。絕大多數(shù) snoRNA 的宿主基因編碼的蛋白或者轉(zhuǎn)錄本為核糖體的生物合成與功能所必須,且作為 5′末端寡嘧啶家族參與生長依賴的翻譯調(diào)控。 snoRNAs 參與的生物學過程主要有 rRNA 的加工處理,RNA 剪接和翻譯過程的調(diào)控以及氧化應(yīng)激反應(yīng)[4]。由于 snoRNA 被認為主要存在于核仁中,功能單一,之后的很長一段時間,snoRNA 的研究陷入低潮。然而,近幾年,隨著測序技術(shù)的發(fā)展,越來越多的數(shù)據(jù)表明 snoRNA 在腫瘤中被異常調(diào)控,還參與到遺傳性疾病、造血、代謝以及癌癥的過程中。
1. snoRNAs 的生物合成
snoRNAs 主要包含兩個家族:C/D box snoRNAs 與 H/ACA box snoRNAs [5] (圖 1)。大多數(shù) snoRNAs 主要位于由 RNA 聚合酶 II 轉(zhuǎn)錄的基因的內(nèi)含子區(qū)域。但 snoRNAs 也可以來源于長鏈非編碼 RNA(lncRNA)的內(nèi)含子區(qū)域。從內(nèi)含子上脫離后,pre-snoRNAs進一步的被核酸外切酶處理去除兩端的多余序列,進而形成成熟的 snoRNAs。snoRNAs內(nèi)部的信號序列指導 snoRNAs 與相應(yīng)蛋白結(jié)合形成 snoRNP 復(fù)合物來避免被酶切,進而發(fā)揮功能。snoRNP 復(fù)合物能夠分為兩類 C/D box snoRNP 和 H/ACA box snoRNP。C/D box snoRNP 包含四種進化上保守的,必需的蛋白質(zhì),即纖維蛋白(fibrillarin)/Nop1p、Nop56、Nop58/Nop5p 和 p15.5KD/ Snu13p,而 H/ACA box snoRNP 的結(jié)合蛋白包括進化保守的 Cbf5p(dyskerin)、Gar1p、Nhp2p 和 Nop10p。
圖1 box C/D snoRNA、 box H/ACA snoRNA結(jié)構(gòu)以及生物合成(圖片來源:Thorenoor, N. and O. Slaby (2015))
圖2 snoRNAs的生物學功能(圖片來源:Makarova, J. A., S. M. Ivanova, et al. (2013))
2. snoRNAs的生物學功能[6](圖2)
1)snoRNAs 與核糖體 RNA 加工
在核糖體 RNA 的加工過程中,核糖體 RNA 的 2′-O–甲基化由 C/D box snoRNAs 來負責。 C/D box snoRNAs 包含有兩個短的序列元件,即位于 5 " 末端的 box C(RUGAUGA R 代表 A 或 G)和 3" 末端的 box D(CUGA)。多數(shù) box C/ D snoRNAs 基因的 5" 和 3" 末端都有 4 -5 nt 的反向重復(fù)序列,可以形成較為穩(wěn)定的短莖結(jié)構(gòu),這一結(jié)構(gòu)在 snoRNAs 的生物合成和核仁定位過程中起關(guān)鍵作用[7]。核糖體 RNA 的假尿嘧啶修飾主要是由 H/ACA box snoRNAs 來完成的。H/ACA box snoRNAs 具有保守的“發(fā)夾-鉸鏈-發(fā)夾-尾”的二級結(jié)構(gòu)。box H (ANANNA,N 代表任一核苷酸)位于單鏈形式的鉸鏈區(qū),ACA則一般位于 3" 末端上游 3 個核苷酸處。H/ACA box snoRNAs 的指導序列位于單個或者兩個發(fā)夾內(nèi)部的“假尿嘧啶化泡”內(nèi),它們可以與靶 RNA 上的被修飾位點兩翼序列各形成 4-8nt 的互補配對。
2)snoRNA 與 mRNA 3’末端加工
在一項新的研究中,研究人員通過生化分析和大規(guī)模測序,發(fā)現(xiàn) mRNA 3'末端加工復(fù)合體和部分 snoRNA 相互作用。在對其中的一種 snoRNA 富含 U/A 的 SNORD50A 進一步開展體外實驗和體外實驗,結(jié)果表明 SNORD50A 在 mRNA 3'末端加工中主要發(fā)揮著一種競爭性抑制的用,并最終影響 mRNA 水平的表達[8](圖 3)。
3)snoRNAs 與應(yīng)激反應(yīng)
snoRNAs 有助于細胞應(yīng)對應(yīng)急反應(yīng)。棕櫚酸酯處理能夠?qū)е录毎?SNORDs 32A, 33以及 35A 的表達水平也顯著提高。細胞對棕櫚酸酯產(chǎn)生抗性是由于抑制了 SNORDs 32A,33和35A 的表達,它們介導了由誘導劑引起的細胞死亡[9]。在缺氧條件下,SNORD14A和 SNORD83B 的表達水平得到顯著提高[10]
4)snoRNAs 派生的小 RNAs
miRNA 在一系列調(diào)控過程中起著重要作用,如細胞存活和細胞增殖的調(diào)控, 由 snoRNAs 產(chǎn)生的 sno-miRNAs 產(chǎn)生的小 RNA 具有雙重功能,同樣的轉(zhuǎn)錄本可以作為 snoRNA 和 miRNA 的前體。ACA45 是第一個被報道能夠被降解成短片段 snoRNAs,它是通過與 Ago 蛋白的相互作用被發(fā)現(xiàn)的,而 Ago 作為 miRNA RISC 復(fù)合物的成員,這就表明 ACA45 的進一步的加工處理是依賴于 Dicer 酶的。降解產(chǎn)生的 20-22nt 的短片段 RNA 的作用機制類似與 miRNA 抑制目的基因(CDC2L6)的表達[11]。很多研究揭示了 snoRNAs 可能參與抑癌基因 P53 的調(diào)控,snoRNA 來源的 miR-605 被報道能抑制 MDM2 蛋白合成,從而促進抑癌基因 P53 的表達(圖 4)近期報道發(fā)現(xiàn) 11 個 C/D box snoRNAs 能夠降解形成短片段 RNA 從而抑制靶基因的表達[12]。在最新的研究中 snoRNAs 進一步被加工成更小的 RNAs 被稱為 sno 派生的 RNAs (sdRNAs),通過對來自 32 種癌癥類型的 10262 例患者樣本的~22 nt 大小的 smRNA-seq 數(shù)據(jù)集的綜合分析,研究人員繪制了泛癌 sdRNAome 的圖譜,結(jié)合多個臨床相關(guān)特征上的特征,特別是癌癥免疫和臨床結(jié)果。大量的 sdRNAs 與腫瘤免疫微環(huán)境特征顯著相關(guān),如免疫抑制標志物、CD8+ T 細胞浸潤、細胞溶解性 T 細胞活性、腫瘤血管組織等[13]。
圖3 snoRNA與mRNA 3’末端加工(圖片來源:Huang, C., J. Shi, et al. (2017))
圖4 microRNA和snorna介導的p53正反饋環(huán)(圖片來源:Liao J, et al.. 2010.)
5)特殊的 Sno-lncRNA
在 2012 年由上海生化所陳玲玲課題組率先鑒定出來, Sno-lncRNA 是一類新型的長非編碼 RNA,它們的序列中包含完整的 snoRNA 序列,并且該序列對 sno-lncRNA 的穩(wěn)定性和亞細胞定位至關(guān)重要,研究表明 sno-lncRNA 長非編碼 RNA SLERT 通過松弛 DDX21 的環(huán)形結(jié)構(gòu),從而促進 Pol I 轉(zhuǎn)錄 rRNA 的重要作用[14]。
6)snoRNAs 與腫瘤發(fā)生發(fā)展
snoRNAs 參與的癌癥的分子病理學,在早年的研究中在非小細胞肺癌中多種 snoRNAs 呈現(xiàn)出不同的表達狀態(tài)[15]。snoRNAsU50 2bp 純合缺失突變與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[16]并且在乳腺癌中 U50 具有雜合缺失以及轉(zhuǎn)錄下調(diào)的特點[11]。通過基因組芯片技術(shù)檢測到 SNORD33, SNORD66, SNORD73B, SNORD76,SNORD78, and SNORA42 六種 snoRNAs 在非小細胞肺癌(NSCLC)是表達上調(diào)的他們通常位于肺癌的頻繁擴增的基因組區(qū)域[17]。snoRNAs 與腫瘤的關(guān)系也能夠延伸到與它們相互作用的蛋白分子上。 Fibrillarin 是發(fā)育必須的,缺失 Fibrillarin 能夠?qū)е屡咛ブ滤?。在乳腺癌的研究中當高水平?Fibrillarin 干擾應(yīng)激激活 p53,snoRNA 通路被抑制時,腫瘤抑制因子 p53 可以作為 snoRNP 擾動的前哨,激活其介導生長抑制作用[18]。Dyskerin、NOP10以及 Nhp2p 的突變與上皮癌有關(guān)[19]。snoRNAs 以及 snoRNP 很可能是通過影響核糖體和蛋白的翻譯來影響腫瘤的發(fā)生的,因為在癌細胞中翻譯過程總是異常的。但是 snoRNAs 也可能通過降解的短片段 RNA 來發(fā)揮 miRNA 功能進而調(diào)節(jié)基因的表達來影響腫瘤的發(fā)生。最新的研究發(fā)現(xiàn),一種管家型 snoRNA 分子是著名癌分子 K-RAS 的開關(guān),研究人員調(diào)查了 12 種常見人類癌癥,包括皮膚癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌和肺癌中,10-40%的腫瘤缺失一對稱作為 SNORD50A/B 的 snoRNAs。在人類黑色素瘤和肺癌細胞中, SNORD50A/B 結(jié)合 KRAS 時,它會抑制 KRAS 蛋白結(jié)合一種稱作為法尼基轉(zhuǎn)移酶的活化分子的能力。法尼基轉(zhuǎn)移酶改變 KRAS 蛋白使得它能夠去到細胞膜等待外部生長及分裂信號[20]。2017 年研究者通過 RNA-seq 對比 Aes(癌基因)缺失前后轉(zhuǎn)錄組的變化,意外發(fā)現(xiàn)大量的 snoRNA 下調(diào),而在過表達 Aes 后 snoRNA 表達量顯著上升,這說明 Aes 能影響 snoRNA 的表達,敲除單個 snoRNA,rRNA 的甲基化顯著降低,并且抑制白血病細胞的克隆形成能力[21]。
6)snoRNAs 作為癌癥診斷和預(yù)后生物標志物
snoRNAs 在細胞中的功能是多樣的,腫瘤特異表達的 snoRNAs 可能作為癌癥相關(guān)的生物標志物。研究報道 snoRNAs 能夠在外周血漿以及血清中穩(wěn)定存在且可測,這使 snoRNAs 作為潛在的循環(huán)腫瘤生物標志物成為可能 [22] 。在非小細胞肺癌中 SNORD33,SNORD66 和 SNORD76 不僅在腫瘤中高表達并且在血漿中也檢測到高表達,這使辨別非小細胞肺癌患者成為可能[23]。SNORA42 雖在組織相關(guān)疾病的預(yù)后檢測效果較差,但可以預(yù)測疾病[24]。SNORD43, SNORD44 和 SNORD48 作為乳腺癌和頭頸部鱗狀細胞癌潛在的抑制劑[25]。SNORD113-1 在原發(fā)性肝細胞癌中表達下調(diào)并且在原發(fā)性肝細胞癌中作為抑癌基因發(fā)揮功能[26]??傊瑂noRNAs 可以作為癌癥診斷和預(yù)后的潛在的生物標志物。snoRNAs 作為癌癥治療的潛在靶點,例如,snoRA42 在肺癌中是高表達的,在肺癌細胞中選擇性的沉默 snoRNAs42,細胞的增殖能力和活力明顯下降。
7)snoRNAs與疾病
SNORD116的缺失是導致Prader Willi綜合癥發(fā)病的主要原因。SNORD115表達水平的變化導致了各種心理和行為畸變典型自閉癥[27]。同時另外一項研究報道在病毒感染的細胞中一系列snoRNAs一方面snoRNAs可以作為受體抗病毒反應(yīng)的調(diào)節(jié)者;另一方面,調(diào)控RNA的活性可以被病毒利用使其逃避天然免疫從而完成其生命周期[28]。在之前的研究中,C/D box snoRNAs 表達水平的變化也發(fā)生在孕婦酒精消耗引起的異常胎兒大腦發(fā)育的過程中,在此過程中SNORD115表達上調(diào),SNORD116表達下調(diào)[29]。最新的研究者繪制了哺乳動物大腦snRNA和snoRNA表達圖譜,發(fā)現(xiàn)哺乳動物大腦snRNA和snoRNA表達水平存在廣泛差異。其中U1和SNORA29表達量在人腦中卻發(fā)生了巨大變化[30]。
研究案例
1)“Germline Duplication of SNORA18L5 Increases Risk for HBV-related Hepatocellular Carcinoma by Altering Localization of Ribosomal Proteins and Decreasing Levels of p53” Gastroenterology 2018(IF=20.773)[26]
該研究是基于生殖系拷貝數(shù)變異(CNV)的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS),通過對比1583例乙型肝炎病毒(HBV)相關(guān)的肝癌患者與1540例乙型肝炎病毒(HBV)相關(guān)的非肝癌患者,發(fā)現(xiàn)了一個低頻重復(fù)染色體15q13.3與乙型肝炎病毒相關(guān)的肝癌患病風險密切相關(guān)(P=3.17×10–8;odds ratio, 12.02)。15q13.3的拷貝數(shù)與SNORA18L5在肝組織中的表達相關(guān)。過表達SNORA18L5的增加了小鼠肝癌細胞的增殖和移植瘤的生長;干擾SNORA18L5降低了肝癌的增殖和腫瘤的生長。SNORA18L5在HepG2和SMMC-7721細胞中的過表達可抑制p53依賴性細胞周期阻滯和凋亡。SNORA18L5的過表達導致核糖體生物合成活性增強,成熟的18S和28S rRNA水平升高,導致核糖體蛋白RPL5和RPL11停留在核仁中,從而阻止它們與MDM2結(jié)合。這導致了MDM2介導的p53泛素化和降解的增加。與非腫瘤肝組織相比,HCC組織中SNORA18L5水平升高,且患者生存時間縮短。該研究深入淺出的從中國人口全基因組的生殖拷貝數(shù)的突變?nèi)胧诌M一步揭示了CNV的突變通過snoRNA的差異表達來影響乙型肝炎病毒(HBV)相關(guān)的肝癌。
圖5 15q13.3的拷貝數(shù)突變位點與SNORA18L5相吻合
圖6細胞與動物實驗證明SNORA18L5與腫瘤細胞增殖的關(guān)系
圖7 SNORA18L5與MDM2以及抑癌基因P53
2)“AML1-ETO requires enhanced C/D box snoRNA/RNP formation to induce self-renewal and leukaemia”Nature Cell Biology 2017(IF:20.060) [21]
白血病發(fā)生需要增強由致癌基因引起的自我更新。其潛在的分子機制尚不完全清楚。本文確定C/D box snoRNAs和rRNA甲基化是白血病干細胞活性的關(guān)鍵決定因素。Aes基因在有融合基因AML1-ETO, PML-RARα和PLZF-RARα的白血病中高表達,但是其功能和機制一直是未知的。研究者通過老鼠模型和細胞系實驗,發(fā)現(xiàn)Aes對腫瘤細胞的自我更新能力是至關(guān)重要的。研究者通過RNA-seq對比Aes(癌基因)缺失前后轉(zhuǎn)錄組的變化,意外發(fā)現(xiàn)大量的snoRNA下調(diào),而在過表達Aes后snoRNA表達量顯著上升,這說明Aes能影響snoRNA的表達。有趣的是,研究者利用CRISPR技術(shù)敲除snoRNA后,發(fā)現(xiàn)即使是敲除單個snoRNA,rRNA的甲基化顯著降低,并且抑制白血病細胞的克隆形成能力。這說明,snoRNA不僅是一類受癌細胞調(diào)控的非編碼RNA,更參與了癌癥的發(fā)生發(fā)展。AES通過與RNA解旋酶DDX21相互作用誘導snoRNA/RNP形成。
圖8 Aes的缺失導致snoRNA的下調(diào)
3)“The noncoding RNAs SNORD50A and SNORD50B bind K-Ras and are recurrently deleted in human cancer” Nature genetics 2016 (IF=27.125) [20]
研究人員發(fā)現(xiàn)一對原以為只是充當細胞管家的RNA分子,在超過四分之一的常見人類癌癥中缺失。研究人員比較了21種不同癌癥類型中的5,473個腫瘤基因組及周圍正常組織的基因組。研究人員發(fā)現(xiàn)在12種常見人類癌癥,包括皮膚癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌和肺癌中,10-40%的腫瘤缺失一對稱作為SNORD50A/B的snoRNAs。在人類黑色素瘤和肺癌細胞中刪除SNORD50A/B時,細胞更快速地分裂,顯示出更多的癌性狀。
通過人類蛋白微陣列檢測到SNORD50A/B能直接結(jié)合到KRAS蛋白,當SNORD50A/B結(jié)合KRAS時,它會抑制KRAS蛋白結(jié)合一種稱作為法尼基轉(zhuǎn)移酶(farnesyltransferase)的活化分子的能力。法尼基轉(zhuǎn)移酶改變KRAS蛋白使得它能夠去到細胞膜等待外部生長及分裂信號。SNORD50A與SNORD50B缺失能增加GTP結(jié)合的數(shù)目,激活K-Ras,以及增加法尼基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合到K-Ras并且促進K-Ras異戊二烯化,這些均揭示了K-Ras的突變與SNORD50A與SNORD50B缺失起協(xié)同作用。
圖9 多數(shù)據(jù)庫分析SNORD50A/B在腫瘤中的缺失以及SNORD50A/B與KRAS蛋白的直接結(jié)合
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