LncRNA在不同癌癥類型中異常調(diào)節(jié)被認(rèn)為是人類癌癥發(fā)生和進(jìn)展的重要調(diào)控元素。但是其在胃癌(GC)中的作用仍有較大空白。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA THAP7-AS1被SP1轉(zhuǎn)錄激活然后被METTL3介導(dǎo)的m6A修飾穩(wěn)定,進(jìn)而提高CUL4B進(jìn)入核中,從而發(fā)揮了原癌特性。本文于2021年10月發(fā)表在《Cell Death and Differentiation》IF:15.828期刊上。
技術(shù)路線:
主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
1、THAP7-AS1在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌樣本中上調(diào)
對(duì)10例GC樣本和2例非腫瘤胃組織進(jìn)行芯片分析,獲得lncRNA的差異表達(dá)譜,包含989個(gè)上調(diào)lncRNA(圖1A)。只有2個(gè)lncRNA,LOC100133669和THAP7-AS1滿足以下條件:差異倍數(shù)大于5,P<0.05,在GC中顯著上調(diào)(圖1B)。但是在72個(gè)GC臨床樣本中,只有THAP7-AS1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(LNM)的組織中的表達(dá)顯著非LNM組織(圖1C-D)。因此被初步選為候選基因。隨后發(fā)現(xiàn)THAP7-AS1同時(shí)定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì),并能穩(wěn)定表達(dá)(圖1E-J)。
圖1 THAP7-AS1在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌樣本中上調(diào)
2、在GC細(xì)胞中SP1激活THAP7-AS1的轉(zhuǎn)錄
對(duì)THAP7-AS1進(jìn)行啟動(dòng)子分析,如圖2A-B,啟動(dòng)子207區(qū)域活性顯著低于509區(qū)域,表明-509-207區(qū)域是THAP7-AS1完整轉(zhuǎn)錄活性所需要的。隨后預(yù)測了5個(gè)與THAP7-AS1結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,發(fā)現(xiàn)當(dāng)過表達(dá)SP1,KLF5,EGR1后THAP7-AS1啟動(dòng)子509-0區(qū)域活性顯著升高,但是只有SP1可以促進(jìn)THAP7-AS1的表達(dá)(圖2C-E)。為了確定SP1上3個(gè)與THAP7-AS1結(jié)合的位點(diǎn)的實(shí)際作用,進(jìn)行了單位點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示SP1-1,SP-1-2和SP-1-3突變質(zhì)粒的THAP7-AS1啟動(dòng)子的活性顯著下降,且下降倍數(shù)不同,表明3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)各自獨(dú)立作用(圖2F-G)。ChIP結(jié)果顯示,SP1可以和THAP7-AS1啟動(dòng)子之間結(jié)合,并且兩者的表達(dá)呈正相關(guān)(圖2H-J)。以上表明SP1結(jié)合THAP7-AS1啟動(dòng)子進(jìn)而激活其轉(zhuǎn)錄。
3、METTL3介導(dǎo)m6A修飾通過IGF2BP1依賴的RNA穩(wěn)定性增強(qiáng)THAP7-AS1表達(dá)
m6A修飾被認(rèn)為是最普遍的內(nèi)部RNA修飾,涉及到RNA的降解,穩(wěn)定性和剪切。為了評(píng)估m(xù)6A修飾在THAP7-AS1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中的重要作用,對(duì)THAP7-AS1序列進(jìn)行了m6A修飾預(yù)測,發(fā)現(xiàn)其包含7個(gè)潛在的修飾位點(diǎn)。MeRIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示THAP7-AS1確實(shí)存在m6A修飾(圖2K-L)。此外,過表達(dá)或敲除METTL3,而不是METTL14,可以顯著性增加或減少THAP7-AS1的水平(圖2M-P)。并且和非LNM組織比較,METTL3的表達(dá)在LNM中顯著上調(diào),其表達(dá)和THAP7-AS1表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(圖2Q-R)。RNA pull-down實(shí)驗(yàn)表明THAP7-AS1可以和METTL3直接結(jié)合(圖2P-Q)。敲除IGFBP1,而不是IGFBP2-3,導(dǎo)致THAP7-AS1表達(dá)下降,并且敲除IGFBP1后THAP7-AS1的穩(wěn)定性下降,RIP也發(fā)現(xiàn)IGFBP1和THAP7-AS1的直接結(jié)合(圖2S-U)。此外,在METTL3沉默的GC細(xì)胞中,IGFBP1和THAP7-AS1的結(jié)合顯著下降。因此,以上表明METTL3介導(dǎo)的m6A修飾通過IGFBP1依賴的增強(qiáng)THAP7-AS1穩(wěn)定性提高其表達(dá)。
圖2(下部分)THAP7-AS1由METTL3介導(dǎo)的m6A修飾轉(zhuǎn)錄后穩(wěn)定
4、THAP7-AS1促進(jìn)GC細(xì)胞體內(nèi)外的生長,遷移和侵襲
如圖3所示,過表達(dá)THAP7-AS1顯著促進(jìn)GC細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲,沉默則相反。在體內(nèi),過表達(dá)THAP7-AS1增加了腫瘤體積,和肺轉(zhuǎn)移。
圖3 THAP7-AS1促進(jìn)GC細(xì)胞體內(nèi)外的生長,遷移和侵襲
5、THAP7-AS1結(jié)合CUL4B的核定位信號(hào)區(qū)域,介導(dǎo)CUL4B進(jìn)入細(xì)胞核
近來研究表明lncRNA通過和蛋白質(zhì)相互作用發(fā)揮功能,作者推測THAP7-AS1也可能是通過這種方式介導(dǎo)GC惡性表型。RNA pull-down和MS實(shí)驗(yàn)鑒定了與THAP7-AS1結(jié)合的蛋白,包括CUL4B和STAT3(圖4A)。但是只有CUL4B在GC細(xì)胞中特異性結(jié)合THAP7-AS1(圖4B-D)。隨后,作者構(gòu)建了一系列截?cái)嗤蛔凅w去探究它和CUL4B的結(jié)合區(qū)域,發(fā)現(xiàn)THAP7-AS1的1-442nt區(qū)域是和CUL4B結(jié)合所必須的(圖4E)。FISH證實(shí)了兩者的共定位(圖4F),但是作者發(fā)現(xiàn)THAP7-AS1并不能改變CUL4B的表達(dá)(圖5A,E),提示THAP7-AS1不參與CUL4B的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。有趣的是,慢病毒轉(zhuǎn)染THAP7-AS1后,細(xì)胞質(zhì)中CUL4B表達(dá)減少,細(xì)胞核中CUL4B表達(dá)增加(圖4G-H),表明THAP7-AS1促進(jìn)CUL4B蛋白進(jìn)入細(xì)胞核。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)THAP7-AS1提高了NLS和importin α1的結(jié)合能力(圖4I-K),并且THAP7-AS1直接結(jié)合CUL4B的NLS區(qū)域(圖4L-O);THAP7-AS1也可以直接結(jié)合importin α1(圖4P-S)。表明THAP7-AS1與importin α1和CUL4B的NLS區(qū)域結(jié)合,從而促進(jìn)CUL4B和importin α1的結(jié)合。隨后的挽救實(shí)驗(yàn)證實(shí)了THAP7-AS1的生物學(xué)功能是通過CUL4B的核易位(圖4T-U)??傊陨媳砻鱐HAP7-AS1結(jié)合CUL4B的核定位信號(hào)區(qū)域,介導(dǎo)CUL4B進(jìn)入細(xì)胞核,進(jìn)而促進(jìn)了GC細(xì)胞的惡性表型。
圖4 THAP7-AS1結(jié)合CUL4B的核定位信號(hào)區(qū)域,介導(dǎo)CUL4B進(jìn)入細(xì)胞核
6、THAP7-AS1/CUL4B復(fù)合物可啟動(dòng)miR-22-3p/miR-320抑制PI3K/AKT信號(hào)通路
為了鑒定參與THAP7-AS1/CUL4B復(fù)合物介導(dǎo)的生物學(xué)功能的潛在基因,對(duì)si-THAP7-AS1和對(duì)照HC細(xì)胞進(jìn)行了RNA測序。與對(duì)照相比,在THAP7-AS1/CUL4B干擾組總計(jì)獲得6502個(gè)上調(diào)基因,5794個(gè)下調(diào)基因。如圖5的WB和RT-qPCR結(jié)果所示,PI3K/AKT信號(hào)通路上的基因,包括PIK3CA,PIK3CD,AKT3,顯著響應(yīng)THAP7-AS1或CUL4B的干擾或過表達(dá)處理;白合成抑制劑環(huán)己亞胺(CHX)和蛋白酶體抑制劑MG132處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,THAP7-AS1/CUL4B是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控上述PI3K/AKT信號(hào)通路上的基因表達(dá),而不影響他們的穩(wěn)定性和降解。
圖5 THAP7-AS1/CUL4B復(fù)合物啟動(dòng)PI3K/AKT信號(hào)通路
鑒于miRNAs常見的轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控因子,所以作者猜測miRNA可能參與CUL4B對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路上的基因表達(dá)的調(diào)控。如圖6所示,作者使用GSE數(shù)據(jù)和在線預(yù)測獲得了5個(gè)候選miRNAs,進(jìn)一步驗(yàn)證后鎖定了miR-22-3p/miR-320a,隨后實(shí)驗(yàn)證實(shí)AKT3是miR-22-3p的靶基因,而miR-320a 可同時(shí)靶向調(diào)節(jié)PIK3CA,PIK3CD,AKT3蛋白的表達(dá),挽救實(shí)驗(yàn)也再次證實(shí)了這個(gè)結(jié)果。總之,以上表明THAP7-AS1/CUL4B復(fù)合物通過miR-22-3p/miR-320靶向抑制PI3K/AKT信號(hào)通路。
圖6 THAP7-AS1/CUL4B復(fù)合物可啟動(dòng)miR-22-3p/miR-320a抑制的PI3K/AKT信號(hào)通路
7、THAP7-AS1/CUL4B復(fù)合物轉(zhuǎn)錄抑制miR-22-3p/miR-320a表達(dá)通過CUL4B催化H2AK119ub1和EZH2介導(dǎo)的H3K27me3
研究發(fā)現(xiàn)CUL4B通過單泛素化H2AK119調(diào)控腫瘤抑制子的表觀遺傳失活。EZH2是PRC2的催化亞基,對(duì)于形成穩(wěn)定的、酶活性強(qiáng)的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物至關(guān)重要。為了檢測miR-22-3p和miR320a的表達(dá)是否受到上述表觀遺傳修飾的調(diào)控,用5-AZ、TSA和Dznep處理GC細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)在TSA和Dznep組顯著上調(diào)(圖7A-B),表明其啟動(dòng)子存在組蛋白甲基化和組蛋白乙?;?笴UL4B、EZH2、H2AK119ub1、H3K27me3、HDAC1和HADC2或?qū)φ誌gG的ChIP檢測顯示,CUL4B(圖7C, G)、EZH2(圖7D, H)、H3K27me3(圖7E, I)和H2AK119ub1(圖7F, J),有效地免疫沉淀了miR-22-3p和miR-320a的啟動(dòng)子區(qū)域,表明它兩可被CUL4B催化的單泛素化H2AK119和PRC2-介導(dǎo)的H3K27me3調(diào)控。
敲除CUL4B導(dǎo)致CUL4B,EZH2,H3K27me3,H2AK119ub1綁定到miR-22-3p和miR-320a啟動(dòng)子顯著減少。這表明CUL4B調(diào)節(jié)miR-22-3p和miR320a的轉(zhuǎn)錄抑制是通過招募PRC2(圖7K-R)。THAP7-AS1過表達(dá)導(dǎo)致與miR-22-3p和miR-320a啟動(dòng)子結(jié)合的CUL4B和EZH2顯著增加,表明THAP7-AS1參與了CUL4B介導(dǎo)的PRC2招募(圖7S-V)。CUL4B敲低逆轉(zhuǎn)了THAP7- AS1過表達(dá)引起的pri-miR-22-3p/pri-miR-320a的下降,反之亦然(圖7W, X)。綜上所述研究表明THAP7-AS1/CUL4B復(fù)合物通過CUL4B催化的H2AK119ub1和ezh2介導(dǎo)的H3K27me3在轉(zhuǎn)錄水平抑制miR-22-3p/miR-320a的表達(dá)。
圖7 THAP7-AS1-CUL4B復(fù)合物可通過CUL4B催化的H2AK119ub1和EZH2介導(dǎo)的H3K27me3轉(zhuǎn)錄抑制miR-22-3p/miR-320a的表達(dá)
8、THAP7-AS1可作為胃癌患者的預(yù)后和治療標(biāo)志物
如圖8所示,THAP7-AS1高表達(dá)患者的LNM危險(xiǎn)性更高,總體生存率更差,敲除THAP7-AS1后腫瘤大小和腫瘤下降,Ki67陽性率下降。提示THAP7-AS1可作為胃癌患者的預(yù)后和治療標(biāo)志物。
圖8 THAP7-AS1可作為胃癌患者的預(yù)后和治療標(biāo)志物
綜上所述,lncRNA在人GC組織中產(chǎn)生了差異表達(dá)譜。THAP7-AS1是一種新的促進(jìn)GC進(jìn)展的lncRNA,由SP1轉(zhuǎn)錄激活,并由METTL3介導(dǎo)的m6A修飾轉(zhuǎn)錄后穩(wěn)定。此外,THAP7-AS1促進(jìn)了CUL4B與importin α1的結(jié)合,并增強(qiáng)了CUL4B蛋白進(jìn)入細(xì)胞核的能力。THAP7-AS1/CUL4B復(fù)合物通過CUL4B催化的H2AK119ub1和ezh2介導(dǎo)的H3K27me3轉(zhuǎn)錄抑制miR-22-3p和miR-320a,從而激活PI3K/ AKT信號(hào)通路(圖8H)。本研究結(jié)果突出了GC中l(wèi)ncRNA、miRNA和蛋白之間重要的功能相互作用,提示THAP7-AS1可能成為GC治療的一個(gè)有前景的分子靶點(diǎn)。
參考文獻(xiàn):
Liu Hai-Ting., Zou Yong-Xin., Zhu Wen-Jie., Sen-Liu., Zhang Guo-Hao., Ma Ran-Ran., Guo Xiang-Yu., Gao Peng.(2021). LncRNA THAP7-AS1, transcriptionally activated by SP1 and post-transcriptionally stabilized by METTL3-mediated m6A modification, exerts oncogenic properties by improving CUL4B entry into the nucleus. Cell Death Differ, undefined (undefined), undefined. Doi: 10.1038/s41418-021-00879-9